三、二代测序的流程与质量控制
推荐意见１１：采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则（Ａ，Ⅱ）。
推荐意见１２：样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集（Ａ，Ⅱ）。推荐意见１３：当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检（Ｂ，Ⅱ）。推荐意见１４：实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程（样本采集，样本前处理／核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读）（Ａ，Ⅲ）。推荐意见１５：每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于２×１０７条（即２０Ｍ特异性序列数），此外建议测序序列读长不少于单端５０ｂｐ（Ａ，Ⅲ）。推荐意见１６：对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库（Ａ，Ⅲ）。推荐意见１７：建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数（Ａ，Ⅲ）。（一）样本采集针对患者感染部位的不同，采集的样本类型主要包括静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。不同类型的样本采集需遵循以下原则：①对于无菌体液，如静脉血、脑脊液、胸腔积液、腹水等，需按照严格的无菌操作采集样本，采集前对局部或周围皮肤进行消*处理，消*液需与皮肤作用一定时间，待皮肤干燥后再取样，一般收集第２管标本送检。采集的样本须置于无菌容器内。②对于有菌部位的样本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，应标明样本的采集部位，在样本采集过程中应尽量避免引入该部位的正常菌群，以免干扰后续检测结果。
采集的样本应尽量选取感染部位的体液或组织，可提高检测结果的可信度。若感染部位的样本采集难度较大，可选择外周血液标本，但有可能会降低检测结果的准确性［２５］。
所有采集的感染部位样本均应及时送检。标本远距离运输需采用冷链运输，并保证无菌原则。应严格遵守相应测序厂商的运输标准作业程序（standardoperationpracedure,SOP），尽可能避免冻融环节。对于不能及时送检的样本，应按照前述各个标本的相应要求进行保存［２６］。
（二）样本前处理/核酸抽提及文库建立不同样本类型均来源于疑似感染部位，具有潜在的感染性，在样本处理前需进行灭活处理。对于痰液样本，由于本身黏性较高，为方便后续实验操作，灭活后还需进行液化处理；对于血液样本，需根据实际检测需求决定是否离心进行血浆分离；对于组织样本，为提高核酸提取效率，需预先将其切碎后进行操作。
所有的检测样本均来自人体的不同部位，因此在样本中本身就包含了大量人源细胞（或人源基因组／转录组成分），而且不同类型的样本中人源细胞（或人源基因组／转录组成分）含量也不一致，为提高检测结果的灵敏性，在不影响样本中病原体含量的前提下，可通过差异离心法或过滤等选择性地去除部分人源细胞（或人源基因组／转录组成分）。不同部位的样本经过处理后都要进行核酸提取，核酸的质量是决定二代测序成功的关键，因此不同实验室应建立完整的核酸检测流程，通过测定核酸的完整性或降解程度，制订合格样本的标准。此外，文库制备流程对核酸样本有严格要求，需对每次提取的核酸样本进行定量检测，以确保核酸量满足后续实验要求。针对不同样本类型对提取的核酸进行文库制备，文库制备流程一般包括核酸片段化、末端修复、标签接头连接和ＰＣＲ文库等。提取试剂盒及全流程中各种试剂的选择，都应考虑生产过程中的工程菌和环境污染微生物的核酸残留信息，以及对检测所造成的影响。在操作过程中应严格采取无菌流程，污染防控对标本结果的质量控制至关重要。每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品，以评估每批次样本中是否存在操作或环境带来的污染以及检测流程是否存在异常。参考文献：往期链接：指南血液恶性肿瘤和干细胞移植患者的耶氏肺孢子肺炎诊断指南指南
中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识(一）指南
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